基于BCS分類(lèi)豁免普通口服制劑BE之滲透性研究的思

在一致性評價(jià)的大背景下，國家局根據《國務(wù)院關(guān)于改革藥品醫療器械審評審批制度的意見(jiàn)》（國發(fā)〔2015〕44號）以及《國務(wù)院辦公廳關(guān)于開(kāi)展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價(jià)的意見(jiàn)》（國辦發(fā)〔2016〕8號），以及順應藥物研究開(kāi)發(fā)的現實(shí)出發(fā)，參考了FDA.Guidance for industry: “Waiver of in invo bioequivalence studies forimmediate-release solid oral dosage forms based on a BiopharmaceuticsClassification System”等指南，制定了我國的人體生物等效性試驗豁免指導原則。該指導原則是基于國際公認的生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統（BiopharmaceuticsClassification System，以下簡(jiǎn)稱(chēng)BCS）起草，可用于仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價(jià)中口服固體常釋制劑申請生物等效性（Bioequivalence）豁免。BCS系統是按照藥物的水溶性和腸道滲透性對其進(jìn)行分類(lèi)的一個(gè)科學(xué)架構。當涉及到口服固體常釋制劑中活性藥物成分（Active Pharmaceutical Ingredient，以下簡(jiǎn)稱(chēng)API）在體內吸收速度和程度時(shí)，BCS系統主要考慮以下三個(gè)關(guān)鍵因素，即：藥物溶解性（Solubility）、腸道滲透性（Intestinal permeability）和制劑溶出度（Dissolution）。

 

 

根據BCS分類(lèi)系統，藥品被分為以下四類(lèi)：

 

第一類(lèi)：高溶解性、高滲透性（High Solubility- HighPermeability）

第二類(lèi)：低溶解性、高滲透性（Low Solubility-HighPermeability）

第三類(lèi)：高溶解性、低滲透性（High Solubility-LowPermeability）

第四類(lèi)：低溶解性、低滲透性（Low Solubility-LowPermeability）

 

指南指出：當口服固體常釋制劑在體內的溶出相對于胃排空時(shí)間快或非�？�，并且具有很高的溶解度時(shí)，藥物的吸收速率和吸收程度就不會(huì )依賴(lài)于藥物的溶出時(shí)間或在胃腸道的通過(guò)時(shí)間。因此，在這種情況下，對于BCS分類(lèi)1類(lèi)和3類(lèi)的藥物，只要處方中的其他輔料成分不顯著(zhù)影響API的吸收，則不必證明該藥物在體內生物利用度和生物等效的可能性，即生物等效性豁免。

 

（一）對于BCS1類(lèi)的藥物需要證明以下幾點(diǎn)：

 

1．藥物具有高溶解性；

2．藥物具有高滲透性；

3．仿制和參比制劑均為快速溶出（30min>85%），并且制劑中不含有影響主藥成分吸收速率和吸收程度的任何輔料。

 

（二）對于BCS3類(lèi)的藥物需要證明以下幾點(diǎn)：

 

1．藥物具有高溶解性；

2．仿制和參比制劑均具有非�？焖俚娜艹�(15min>85%）)；

3．仿制制劑和參比制劑應處方完全相同，各組成用量相似。

 

藥物溶解性的測定數據相對簡(jiǎn)單易得，且具有良好的重現性。原則中對高溶解性定義為：?jiǎn)未谓o藥的最高劑量對應的API在體積為250ml（或更少）、pH值在1.0—6.8范圍內的水溶性介質(zhì)中能完全溶解�？焖倩蚍浅？焖偃艹鲆部梢圆捎萌艹鰞x進(jìn)行測定獲得。

 

然而，想要BE豁免BCS1、3類(lèi)藥物，存在兩大阻礙：

 

（1）藥物滲透性；（2）輔料不影響藥物吸收速度和吸收程度，這二者均不易證明。因僅僅通過(guò)文獻報道的研究來(lái)說(shuō)服審評機構是及其困難的，這也能從FDA、PMDA等監管機構對BE豁免所持的謹慎態(tài)度上可見(jiàn)一般。對于可能影響藥物吸收轉運的輔料包括表面活性劑、滲透壓調節劑（甘露醇、山梨醇等）、以及脂質(zhì)（硬脂酸甘油酯、油酸等），如參比制劑處方包含了此類(lèi)物質(zhì)，監管機構對于BE豁免上至少應會(huì )要求仿制藥企業(yè)證明其用量完全一致，甚至可能還要求研究表面活性劑分子量分布或者表面活性劑溶出速率，均不易證明。

 

對于滲透性，目前FDA、EMA等審評綜述中都會(huì )披露原研企業(yè)所做的藥物BCS分類(lèi)研究結果，但其可信程度需要仿制藥企業(yè)進(jìn)行深入而細致地分析與核實(shí)，以免掉進(jìn)“坑”中而不自知。以達沙替尼為例，在FDA公開(kāi)的綜述文件Sprycel_ClinPharmR中，我們可以找到其BCS為2類(lèi)，即低溶解度高滲透性。原文可在綜述中第39頁(yè)找到，如下：

 

                           

溶解度數據也在同一頁(yè)內，溶解度為pH依賴(lài)性，pH7.0時(shí)<1μg/ml，pH6時(shí)~8μg/ml，如下：

 

 

 

滲透性研究結論如下：

 

 

資料顯示采用了caco-2細胞實(shí)驗模型（一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類(lèi)似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結構，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，可用來(lái)模擬體內腸轉運的實(shí)驗。）通過(guò)與FDA推薦的高滲透性?xún)葮怂幬锩劳新鍫柡偷厝姿杀容^，確定達沙替尼為高滲透性藥物。如就此認為其定義為高滲透性是合理的，那我們就會(huì )掉入 “陷阱”。

 

首先，FDA審評員在上圖中指出滲透性結果應refer to section 2.2.5.5 for in vivo permeability。我們找到p26中此部分內容，其旨在研究達沙替尼是主要通過(guò)腎臟或肝臟代謝的消除途徑；通過(guò)測定放射性標記藥物，表明達沙替尼腎臟消除量非常低，而超過(guò)85%的通過(guò)糞便消除，糞便中原形藥比例為19.1%，結果如下圖：

 

 

同時(shí)給藥后2h血漿中達沙替尼M21代謝物（sulfate conjugate，磺酸復合物）水平達到總放射活性的9.5%，表明達沙替尼可能會(huì )在胃腸道經(jīng)硫酸脂酶代謝。

 

 

綜上分析，達沙替尼原形藥19.1%通過(guò)糞便排泄，表明其體內絕對生物利用度應小于85%，且藥物在胃腸道存在被代謝可能。

 

FDA 2015年BE豁免指南[1]中對于高滲透性的定義為：

 

A drug substance is considered to be highly permeable when the extentof  absorption in humans is determined tobe 85 percent or more of an administered dose based on a mass balancedetermination (along with evidence showing stability of the drug in the GItract) or in comparison to an intravenous reference dose.即相對與所給藥劑量，口服吸收程度≥85%（基于質(zhì)量平衡研究-同時(shí)證明藥物在胃腸道的穩定性；或與靜脈注射相比）。

 

高滲透性測定依據：

 

Thepermeability class of a drug substance can be determined in human subjects using mass balance, orabsolute BA, which are the preferred methods, or intestinal perfusionapproaches. In many cases, a single method may be sufficient: (i) when theabsolute BA is 85 percent or more, or (ii) when 85 percent or more of theadministered drug is excreted unchanged in urine, or (iii) when 85 percent ormore of the administered drug is recovered in urine as parent and metaboliteswith evidence indicating stability in the GI tract. 滲透性可通過(guò)人體受試者的質(zhì)量平衡或絕對生物利用度（優(yōu)先選擇）或腸道灌注研究確定；如下任一方法均可：1）絕對生物利用度≥85%；2）或≥85%藥物以原型通過(guò)尿排泄；3）或≥85%藥物以原型和代謝物形式從尿液回收-同時(shí)證明藥物在胃腸道的穩定性（胃腸道穩定的前提下尿液中代謝物為系統代謝而非胃腸道代謝后再吸收排泄）；而藥物在USP推薦的模擬胃液1h和模擬腸液中3h的降解>5%被認為不穩定。

 

因此，可以認為原研對達沙替尼體內質(zhì)量平衡研究結果不支持高滲透性判斷依據：85%以上的原型藥物從尿液中排出且胃腸道穩定，更沒(méi)有絕對生物利用度>85%數據，故參考原研審評綜述資料所公布的BCS分類(lèi)結論，就很可能會(huì )誤導仿制藥研究人員。

 

其次，我們如能進(jìn)一步仔細閱讀，還可在p35頁(yè)發(fā)現藥物的外排蛋白（p-gp）底物研究，如下圖：

 

 

研究發(fā)現在Caco-2試驗中藥物濃度為50μM時(shí)，滲透系數A-B端為102nm/s，B-A端為222nm/s，表明達沙替尼為p-gp底物。這份研究結果中可以看到FDA對其研究提出要求：應采用一系列藥物濃度而不僅僅是單一的50μM，以及使用已經(jīng)p-gp底物進(jìn)行陽(yáng)性對照。我們應該看到，達沙替尼分子量488，50μM 濃度換算得24.4μg/ml，該濃度已經(jīng)遠遠超過(guò)藥物在pH7介質(zhì)中的飽和溶解度（<1μg/ml），意味著(zhù)其滲透性結果和p-gp結果都不能反應體內真實(shí)情況。這是因為在采用caco-2細胞模型研究滲透性時(shí)，藥物通常使用DMSO溶解配成高濃度溶液，再稀釋到細胞培養基中，才能獲得50μM的濃度；而人體內因為藥物溶解度低，幾乎不可能達到該濃度，其結果就會(huì )偏離實(shí)際，產(chǎn)生誤導的結論。藥物真實(shí)滲透性需要考慮藥物從A-B端的滲透系數與p-gp等外排蛋白對藥物的外排作用，如果高濃度的藥物可以導致p-gp飽和，則會(huì )提高其滲透性，但未飽和p-gp時(shí)的滲透性會(huì )降低。對達沙替尼而言，其為p-gp底物，且腸道飽和溶解度明顯低于50μM，所測定得到的A-B端滲透系數就可能是偏高的；這也是FDA要求研究不同藥物濃度下的滲透系數之原因。

 

藥物主要在小腸吸收，小腸不同區域的pH值不同，從偏酸性到中性直至弱堿性，也會(huì )影響到酸堿藥物的解離程度從而影響藥物吸收；因此，caco-2細胞試驗中A端（細胞頂膜）的pH也應考慮在內。研究發(fā)現，布洛芬、酮洛芬、匹羅昔康等酸性藥物在pH5.0的滲透系數顯著(zhù)高于pH7.4；而美托洛爾、噻吩洛爾等堿性藥物在pH7.4的滲透性顯著(zhù)高于pH5.0；而這些藥物在人體幾乎完全吸收，生物利用度>90%；因此，caco-2細胞試驗研究滲透性時(shí)，培養基的pH值應當考慮在內的。caco-2細胞實(shí)驗適合用于被動(dòng)轉運的藥物；而對于具有主動(dòng)轉運機制的藥物而言，caco-2細胞實(shí)驗獲得的低滲透性結論就會(huì )導致假陰性判斷。如頭孢氨芐為二肽轉運體底物，盡管其caco-2滲透性低，其體內吸收完全。同時(shí)，對難溶性藥物溶解使用的DMSO在培養基中超過(guò)1%時(shí)，就會(huì )影響caco-2細胞膜的緊密連接，使其出現假陽(yáng)性結論。其他影響細胞緊密連接致密性的還包括藥物濃度、細胞培養條件等，不同實(shí)驗室之間的結果往往難以重現。

 

 

總之，仿制藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中，監管機構對于BE豁免的審批還是很謹慎的。熟悉FDA仿制藥申報的專(zhuān)家曾透露，在美國要證明一個(gè)藥物的高滲透性所需的工作量和費用也不亞于一個(gè)BE，故美國很少普通口服制劑的仿制藥真正通過(guò)BE豁免上市。我國的普通固體口服制劑如希望BE豁免，要說(shuō)服CFDA也同樣不易。