細胞培養基的生產(chǎn)和過(guò)程控制，質(zhì)量標準和檢測

1細胞培養基的生產(chǎn)和過(guò)程控制
 

細胞培養基作為生物制品生產(chǎn)的重要原材料之一，其質(zhì)量對生物制品有重要的影響。細胞培養基的生產(chǎn)工藝和細胞培養基的原材料選用、生產(chǎn)過(guò)程及檢驗過(guò)程中的質(zhì)量控制對于細胞培養基的產(chǎn)品質(zhì)量具有直接影響。其中原材料的成份及其質(zhì)量直接決定了細胞培養基產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性，選擇合適的物料是實(shí)現細胞培養基功能過(guò)程中需要解決的基礎問(wèn)題。生產(chǎn)工藝的選擇（如原料的研碎、混合技術(shù)等）及生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制等直接影響產(chǎn)品的溶解性、批生產(chǎn)量及批次間差異，進(jìn)而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。
 

cGMP稽查員在對國內細胞培養基生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行cGMP審計時(shí)指出，細胞培養基的生產(chǎn)工藝及設備應經(jīng)過(guò)驗證，原材料必須做鑒別試驗，記錄應真實(shí)反映生產(chǎn)過(guò)程的實(shí)際情況，生產(chǎn)過(guò)程偏差處理應包括對出現偏差之前涉及到的批次均應進(jìn)行調查等等。這些要求是基于FDA對生物制藥用原料的質(zhì)量要求方面提出，遠遠高于國內對藥用原料的要求。隨著(zhù)對人用和動(dòng)物保健用生物制品安全性要求的提高，嚴格執行GMP規范進(jìn)行細胞培養基生產(chǎn)是國內細胞培養基行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

 

1.1細胞培養基的原料選擇及質(zhì)量控制
 

1.1.1原材料的選擇

由于動(dòng)物細胞培養基產(chǎn)品屬于藥用原料，《哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞培養基行業(yè)標準》對細胞培養基產(chǎn)品的微生物限度、內毒素含量進(jìn)行了限定，所以細胞培養基所用原料宜采用注射級、藥用級原料。對于部份沒(méi)有注射級和藥用級的原料，細胞培養基制造者針對自身產(chǎn)品質(zhì)量要求，制定一些重要指標（微生物限度、內毒素、重金屬等）進(jìn)行原材料的質(zhì)量控制。
 

1.1.2原材料的質(zhì)量控制

細胞培養基生產(chǎn)企業(yè)建立完善的原材料質(zhì)量標準，對于原材料的來(lái)源、檢驗、使用、及銷(xiāo)毀等有明確的可追溯記錄。在質(zhì)量控制過(guò)程中，藥用級原材料的質(zhì)量標準應參考中國藥典相關(guān)標準，對于非藥用級原材料應根據生產(chǎn)工藝需要與供應商一起共同確定質(zhì)量標準，質(zhì)量標準應包括如下內容：

¨      指定的物料名稱(chēng)和企業(yè)內部使用的物料代碼

¨      藥典專(zhuān)論的名稱(chēng)（如有）

¨      經(jīng)批準的供應商以及原始生產(chǎn)商

¨      印刷包裝材料的樣張

¨      物料質(zhì)量標準依據及其編號

¨      取樣、檢驗方法或相關(guān)規程編號

¨      定性和定量的限度要求

¨      貯存條件和注意事項

¨      復驗前的最長(cháng)貯存期
 

原材料的質(zhì)量檢測主要從材料、人員、方法三個(gè)方面進(jìn)行控制：

1)    具有必要的檢測試劑、設備和設施，如鱟試劑、分析天平、潔凈操作室或取樣柜。

2)    擁有相應操作資質(zhì)和能力的檢驗人員，如相應檢測人員應具備化驗員資質(zhì)并經(jīng)過(guò)全面的技能培訓。

 選擇具有法律效力的檢測方法以及對應的操作規范，在檢測方法的選擇方面藥用原料應優(yōu)先采用藥典方法，非藥用原料應采用經(jīng)過(guò)驗證有效的檢測方法，在確定檢測方法后應制定相應標準操作文件，用于規范試驗操作。
 

應嚴格控制細胞培養基的原材料質(zhì)量管理，并建立相應完善的原材料質(zhì)量管理文件體系。原材料的質(zhì)量管理方面，應明確規定責任范圍和流程方法，它們是保證原材料質(zhì)量的基礎。原材料質(zhì)量管理文件體系內容通常包括兩個(gè)方面，一方面是明確原材料質(zhì)量責任應歸屬的部門(mén)及人員，以實(shí)現分工明確；另一方面是明確原材料的取樣、檢驗、放行、判定不合格、異常情況、偏差、驗證等事務(wù)具體流程，確保流程正確，方法無(wú)誤，為質(zhì)量控制提供依據。

 

1.2細胞培養基生產(chǎn)工藝

 

       傳統的細胞培養基生產(chǎn)工藝即生產(chǎn)過(guò)程通常分為物料配比、物料干燥、物料研碎、物料混合、物料包裝、成品的檢驗等6個(gè)階段，下面結合過(guò)程中的質(zhì)量控制對此工藝進(jìn)行介紹：

 

1.2.1物料配比

 

      物料配比是根據配方要求將各種原料按比例配制的過(guò)程。配制需嚴格執行配方，才能保證細胞培養基產(chǎn)品功能的實(shí)現及降低批間差，而實(shí)現低誤差的物料配比過(guò)程需從以下幾個(gè)方面進(jìn)行控制：

 

1)   提供與生產(chǎn)工藝規程匹配且經(jīng)過(guò)審核的、有效力的物料配方，生產(chǎn)部門(mén)根據配方制定配比操作記錄，經(jīng)質(zhì)量管理部門(mén)審核后，方可投入生產(chǎn)作業(yè)使用；

 

2)   具有詳細明確的經(jīng)過(guò)驗證的設備、設施、工序操作規程以及相關(guān)管理規程，如通過(guò)編制設備、設施的驗證、使用、維護、維修操作規程來(lái)明確操作方法和流程，通過(guò)編制相應管理文件，來(lái)明確人員責任；

 

3)   具有足夠的在校驗有效期內的精確度合理的計量器具，及與產(chǎn)品質(zhì)量要求相匹配的生產(chǎn)環(huán)境設施，如為降低細胞培養基微生物、內毒素限度使用潔凈廠(chǎng)房進(jìn)行生產(chǎn)等；

 

4)   足夠的經(jīng)過(guò)合理培訓具有上崗資質(zhì)的操作人員和設備管理人員（操作員上崗證、計量員證），各崗位操作人員配備足夠，能夠確保操作過(guò)程實(shí)現雙人操作雙人復核；

 

5)   配備足夠的基層管理人員以及現場(chǎng)QA，起到指導和監督作用。

 

1.2.2物料干燥

 

       基于細胞培養基產(chǎn)品營(yíng)養豐富，且不是無(wú)菌制劑的特性，為避免微生物滋生破壞細胞培養基成份，需控制細胞培養基中的水分含量，依據行業(yè)標準要求，其干燥減重質(zhì)量分數應低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要環(huán)節。

 

       目前常用的干燥方法有常壓干燥和冷凍干燥。常壓干燥包括烘干干燥、鼓式干燥、帶式干燥，由于國內細胞培養基生產(chǎn)廠(chǎng)家普遍采用球磨缸進(jìn)行生產(chǎn)，由于各缸獨立，無(wú)法使用鼓式干燥、帶式干燥的方式進(jìn)行連續烘干作業(yè)，所以普遍采用烘干干燥的方式按批進(jìn)行物料干燥。冷凍干燥主要用于不能耐受高溫的貴細物料的干燥處理。

 

1.2.3物料研磨

 

       細胞培養基顆粒越細，同質(zhì)條件下比表面積越大，其溶解性越好，而其成品細度是由物料的研磨過(guò)程直接決定。對于物料的研磨，傳統普遍采用藥用球磨機，其主要優(yōu)點(diǎn)是結構簡(jiǎn)單、操作方便、易于清潔及使物料混合作用（能夠實(shí)現缸體內各種成份的均勻分布）。球磨缸內的研磨球材質(zhì)通常有陶瓷、瑪瑙、不銹鋼（304或316L）。但是球磨機也存在批量小、噪音大、難以控制溫度、粉狀物料不易取出且取料過(guò)程會(huì )產(chǎn)生大量粉塵等缺點(diǎn)。目前國內一些細胞培養基生產(chǎn)企業(yè)在球磨缸取料工序裝備了全密閉自動(dòng)取粉裝置，較好的解決了粉塵污染問(wèn)題，也進(jìn)一步降低了由于物料的裸露可能帶來(lái)的引入異物及物料受潮的風(fēng)險。

 

1.2.4物料混合

 

       混合設備首先必須具備能夠實(shí)現物料均勻性的功能。在上述物料研磨過(guò)程中，可能存在投料微量誤差、過(guò)程參數細微差異以及其他不可控因素，上述因素的累積會(huì )導致不同研磨單元內物料可能出現一定的差異（外觀(guān)、理化性質(zhì)、培養性能），這些差異將直接影響產(chǎn)品的使用，造成使用者生產(chǎn)效率及產(chǎn)品的批間差異。根據哺乳類(lèi)細胞培養基行業(yè)標準中對于“批”的定義，即同一臺混合設備一次混合量所生產(chǎn)的均質(zhì)產(chǎn)品為一批，物料經(jīng)研磨單元研磨以后必須進(jìn)行總混和均勻后才能稱(chēng)為一批成品進(jìn)行包裝。目前常用的物料混合設備以摻和機、雙錐混合機較為常見(jiàn)。

 

1.2.5物料包裝

 

       物料的包裝分為內包裝和外包裝，主要為了實(shí)現如下功能：

 

1)   阻隔性功能：即密閉保存（避光、防潮、防污染、防氧化等），是指直接與產(chǎn)品接觸的內包裝，在選擇內包裝材料時(shí)其阻隔性是關(guān)鍵，高阻隔性包裝薄膜所采用的阻隔性樹(shù)脂主要有EVOH、PA、PET、PVDC、PC、MXD6和聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是開(kāi)發(fā)較早的阻隔性能優(yōu)異的材料，而包裝用薄膜材料結構包括：紙／塑料、塑料／鍍鋁塑料、紙／鋁箔／塑料和塑料／鋁箔／塑料等幾種【11】；

 

2)   產(chǎn)品信息的提供：產(chǎn)品外包裝上應明確標識品名、批號、代碼、生產(chǎn)日期、有效期、使用方法等基礎信息，并隨附企業(yè)質(zhì)量監管部門(mén)下發(fā)的產(chǎn)品合格證以及質(zhì)量檢驗報告等質(zhì)量證明文件；

 

3)   易于運輸的防護：確保外包裝物能夠抵御運輸過(guò)程中裝卸產(chǎn)生撞擊的沖擊，并要具備一定的堆疊強度，對于需要遠途運輸的不能耐受高溫的成品應做好低溫保護工作（填充保溫材料，包裝箱內混裝冰袋、干冰等蓄冷物）。

 

1.2.6成品的檢驗

 

細胞培養基產(chǎn)品生產(chǎn)完畢后，由質(zhì)量檢測部門(mén)對該批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測，在這一周期內，成品處于待驗狀態(tài)，儲存條件應與合格成品一致，應專(zhuān)區存放專(zhuān)人管理，避免混淆和遺漏，在收到質(zhì)量檢測部門(mén)檢測合格予以放行的通知后，轉交成品庫，移入合格品區備售。

 

1.2.7細胞培養基生產(chǎn)的新工藝

 

采用上述傳統的生產(chǎn)工藝（通常稱(chēng)作球磨工藝）生產(chǎn)的產(chǎn)品均一性較好，物化性能穩定以及細胞培養效果較好，但是存在批量小、研磨過(guò)程中的散熱難以控制、噪音及粉塵污染較大等缺點(diǎn)。2005年新開(kāi)發(fā)了一種連續生產(chǎn)的針式研磨系統（pin mill），集“物料混合－針式研磨－研磨后混合”一體，用于工業(yè)化生產(chǎn)干粉細胞培養基，可以用來(lái)生產(chǎn)從10kg至4000kg不等批量的干粉細胞培養基。

 

Pin mill研磨系統是一種高速沖擊研磨系統，包括一個(gè)進(jìn)料口、兩個(gè)同軸帶有研磨針的轉盤(pán)以及一個(gè)出料口。當原料通過(guò)進(jìn)料口投入研磨器后到達轉盤(pán)中央，在轉盤(pán)旋轉離心力的推動(dòng)下往徑向外側運動(dòng)同時(shí)被相互咬合且相對旋轉運動(dòng)的研磨針研細。物料在進(jìn)入針式研磨腔前和完成研磨離開(kāi)研磨設備后都使用混合機進(jìn)行了混合，以確保進(jìn)入研磨器和最終產(chǎn)品的成份均勻性，其生產(chǎn)工藝流程見(jiàn)下圖1-1。


 

圖1-1 pin mill生產(chǎn)干粉細胞培養基工藝流程圖

 

與傳統的球磨生產(chǎn)工藝相比，pin mill 生產(chǎn)系統研磨的顆粒更細，批次控制范圍大且靈活（0.5~4000kg），在研磨及研磨后顆粒輸送的過(guò)程中，采用氮氣控制機體的溫度，使研磨機的溫度保持在40℃以下，并且避免了粉塵污染、交叉污染等。該系統機體的拆分、組裝及清潔也較為簡(jiǎn)單，適合cGMP生產(chǎn)。

 

關(guān)于使用pin mill 系統生產(chǎn)的DPM性能，如生產(chǎn)過(guò)程中的成份組成均質(zhì)性、生產(chǎn)的產(chǎn)品性能及是否適合細胞培養和生物制品生產(chǎn)等，有詳細的驗證研究，結果顯示，pin mill生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品均勻分布性滿(mǎn)足標準，并且均勻性與成份以及批量大小無(wú)關(guān)；生產(chǎn)的產(chǎn)品諸如溶解性、pH、滲透壓等理化性質(zhì)、細胞培養方面及生物制品生產(chǎn)與球磨生產(chǎn)工藝相同。