滲透壓對谷氨酸棒桿菌葡萄糖轉運和高產(chǎn)谷氨酸的影響

摘要：谷氨酸棒桿菌對葡萄糖的攝取主要通過(guò)對葡萄糖具有高親和力(Km=0.35 mM)的甘露糖磷酸轉移酶系統(PTS)。選擇能夠耐受2-脫氧葡萄糖(2DG)和缺乏PEP依賴(lài)的葡萄糖轉運活性的突變體，這些突變體能夠在以葡萄糖為唯一碳源和能源的培養基上生長(cháng)，由于采用的是低親和力(Ks=11 mM)的非PTS攝取系統，所以攝糖速率顯著(zhù)降低。在不同滲透壓的培養基中生長(cháng)，野生型細胞比葡萄糖消耗速率和比生長(cháng)速率降低。當這些培養物的細胞在標準條件下測量時(shí)顯示具有相似的PTS活性。然而，當細胞重新懸浮在不同滲透壓的緩沖液中時(shí)，PTS活性顯示與滲透壓相關(guān)。這種抑制效應能夠解釋在高滲透壓發(fā)酵培養基中觀(guān)察到的糖吸收和生長(cháng)速率下降的原因。但是非PTS葡萄糖轉運系統不受培養基滲透壓的影響。在工業(yè)生產(chǎn)條件下隨著(zhù)谷氨酸積累培養基滲透壓相應增加，觀(guān)察到對糖轉運能力的類(lèi)似抑制。這種現象從而限制了發(fā)酵過(guò)程，因為比速率的降低會(huì )導致細胞維持而消耗的糖比例增加，同時(shí)伴隨著(zhù)產(chǎn)品產(chǎn)率的降低。

關(guān)鍵詞：葡萄糖轉運；滲透壓；谷氨酸發(fā)酵；谷氨酸棒桿菌；

研究?jì)热荩?/span>

1、滲透壓對PTS葡萄糖攝取系統活力的影響

滲透壓800mOsmol/Kg以?xún)萈TS活性維持恒定，之后隨著(zhù)滲透壓升高PTS活性線(xiàn)性下降。滲透壓1900mOsmol/Kg時(shí)PTS活性只有最高時(shí)的15%。

2、滲透壓對谷氨酸發(fā)酵的影響

谷氨酸和次級代謝產(chǎn)物的積累會(huì )引起培養基滲透壓的顯著(zhù)增加，為了維持pH值恒定，堿(在本例中為氨)的加入進(jìn)一步加劇了滲透壓的增加。在谷氨酸棒狀桿菌溫度敏感菌株2262中觀(guān)察到這一現象，該菌株能夠達到高產(chǎn)物濃度(谷氨酸>85g/L)并且滲透壓超過(guò)2000 mOsmol·kg-1。在最初幾個(gè)小時(shí)內糖的消耗率保持不變，然后逐漸下降。為了檢驗活性減弱是否與谷氨酸累積導致的滲透壓增加相關(guān)，測量了PTS活性對總糖攝取量的貢獻，在野生菌谷氨酸棒狀桿菌ATCC 17965中測量的貢獻一致，即4.5 mmol·g-1·h-1。在谷氨酸生產(chǎn)菌株中，總糖攝取更快，表明滲透酶活性更高。在非脅迫條件下測得的葡萄糖攝取速率表明在谷氨酸棒狀桿菌2262中滲透酶貢獻高達25%的總葡萄糖攝取量。按照PTS轉運系統的體外測量方法測定滲透應激對PTS活性的抑制影響，在葡萄糖補料條件下(滲透酶的貢獻可以忽略不計)(低殘留葡萄糖，即小于2g·l-1)，可以看到葡萄糖消耗量的下降與預測的PTS活性下降非常接近(圖3a)。當采用維持較高濃度的葡萄糖補料策略（50 g·l-1），葡萄糖消耗有改善可能是由于滲透酶活性和反應器中存在的葡萄糖對該系統的飽和度高(圖3b)。在這種條件下，高葡萄糖消耗率導致額外代謝物的較早出現，如乳酸。

3、對谷氨酸產(chǎn)率的影響

一旦培養基中的滲透壓增加，代謝活性下降的后果之一是發(fā)酵結束時(shí)谷氨酸產(chǎn)量顯著(zhù)降低。葡萄糖消耗率的下降會(huì )引起谷氨酸產(chǎn)率的下降，這是由于轉化為CO2的葡萄糖比例增加。在整個(gè)生產(chǎn)階段CO2產(chǎn)量大致保持恒定，這表明從糖分解代謝中獲得生化能量來(lái)滿(mǎn)足細胞維持的需求恒定，這種需求與發(fā)酵罐內的生物量成比例，因此糖比消耗速率的降低需要增加所用糖的比例。當使用谷氨酸棒狀桿菌的維持系數0.6mmol葡萄糖/g細胞/h計算，用于細胞維持需要的葡萄糖的比例從谷氨酸生產(chǎn)的初始階段總糖消耗的15%增加到發(fā)酵后期滲透壓最高時(shí)的40%(圖4)。在發(fā)酵后期觀(guān)察到的谷氨酸產(chǎn)率下降與維持需求的碳代謝流的變化一致。根據代謝活性減弱期間代謝需氧量降低，則根據氧變化控制殘糖濃度可能恢復部分產(chǎn)率損失。

4.討論

本文說(shuō)明了谷氨酸發(fā)酵后期的抑制與產(chǎn)物積累和滲透環(huán)境對糖吸收能力的控制影響直接相關(guān)。這種現象不是由于基因表達水平的變化，而是由于滲透脅迫條件下轉運系統的生化活性發(fā)生了改變。此外，這種效應是可逆的，因為一旦滲透脅迫被消除，被洗滌的細胞仍能恢復其轉運糖的能力。同樣，當重懸于高滲的緩沖液中時(shí)，正常生長(cháng)的細胞糖轉運能力也顯著(zhù)降低。

隨著(zhù)滲透壓的增加，這種生理效應會(huì )導致耗糖能力下降和代謝速率減慢。由于維持生物量的能量要求保持不變，而且在許多情況下會(huì )需要增加額外能量以滿(mǎn)足對抗此類(lèi)壓力，這也將導致產(chǎn)品產(chǎn)率下降。越來(lái)越多的糖消耗將用于能源生產(chǎn)，因此會(huì )以減少產(chǎn)品為代價(jià)，以二氧化碳的形式損失掉。對于谷氨酸發(fā)酵，隨著(zhù)培養基滲透壓的增加，產(chǎn)量和產(chǎn)率均顯著(zhù)降低。引發(fā)PTS蛋白轉運能力下降的生化機制仍有待確定，但可能與蛋白/膜復合體的結構變化相關(guān)。

更高效或更快速地生產(chǎn)谷氨酸的菌株達到滲透閾值將更快，這將導致發(fā)酵24小時(shí)后可能產(chǎn)量不會(huì )提高。因此，篩選具有高耐壓能力的菌株對發(fā)酵是有益的，從而確保工業(yè)菌株足夠健壯，在獲得高產(chǎn)物產(chǎn)量時(shí)能維持高代謝活性。另一條克服這種代謝抑制的路徑則是開(kāi)發(fā)一種發(fā)酵系統，能夠整合下游提取過(guò)程在發(fā)酵積累時(shí)去除產(chǎn)物。